2006年，日本科學(xué)家山中伸彌（Shinya Yamanaka）教授利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入成體細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)變?yōu)檎T導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)。從此后，誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞研究領(lǐng)域取得了很大進(jìn)步，被用于研究人類疾病，目前已經(jīng)有多項(xiàng)研究進(jìn)入到臨床實(shí)驗(yàn)階段。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)已成為目前常使用的基因編輯工具，在基因組中生成靶向DNA雙鏈斷裂（Double strand breaks,DSBs），再通過內(nèi)源性細(xì)胞DNA DSB修復(fù)途徑進(jìn)行修復(fù)。將CRISPR技術(shù)與iPSC技術(shù)結(jié)合，將模擬疾病發(fā)生的突變引入iPSC，或修復(fù)iPSC疾病模型中的突變,再分化得到所需要的特定細(xì)胞進(jìn)行研究或疾病治療，是目前iPSC研究和轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

　　目前，基于CRISPR/Cas9技術(shù)在靶向區(qū)域形成DNA雙鏈斷裂(DSB)，利用非同源末端連接(Non-Homologous End Joining,NHEJ)方法導(dǎo)致插入和缺失突變，而微同源性末端連接(Microhomology-Mediated end Joining,MMEJ)則導(dǎo)致可預(yù)測缺失。NHEJ和MMEJ統(tǒng)稱為誘變末端連接（Mutagenic End Joining，MutEJ），兩種修復(fù)結(jié)果均可導(dǎo)致DNA序列的丟失或增加。與定制修復(fù)模板如供體質(zhì)?；騿捂湽w寡核苷酸（Single-stranded donor oligonucleotide，ssODN）結(jié)合，利用同源定向修復(fù)（Homology-directed repair,HDR）途徑可實(shí)現(xiàn)單核苷酸改變。然而基因準(zhǔn)確敲入效率低下和適用性有限，需要采用定制ssODN模板進(jìn)行優(yōu)化HDR編輯效率。

　　HDR方式是復(fù)雜而準(zhǔn)確的，需要同源序列模板，只能發(fā)生在細(xì)胞G2/S期。NHEJ方式是快速非準(zhǔn)確的，過程中可能會(huì)隨機(jī)的引入和去除幾個(gè)堿基，整個(gè)細(xì)胞周期都有活躍發(fā)生的。有多種策略來提高HDR率，如單獨(dú)控制DNA修復(fù)，細(xì)胞周期進(jìn)程或核酸酶試劑和同源修復(fù)模板可用性，但迄今尚無明確證據(jù)表明這些策略的協(xié)同效應(yīng)。

　　日本京都大學(xué)iPS細(xì)胞研究所的科學(xué)家新研究表明（Nature Communications，2020），DNA DSB修復(fù)與細(xì)胞周期之間有協(xié)同作用，有利于ssOND介導(dǎo)的單核苷酸基因編輯。在iPS細(xì)胞中建立了基于GFP到BFP轉(zhuǎn)化的熒光DNA修復(fù)測定方法，可視化定量單等位基因和雙等位基因靶向過程中DNA修復(fù)結(jié)果的頻率。研究發(fā)現(xiàn)，通過特定培養(yǎng)條件和小分子調(diào)節(jié)DNA修復(fù)和細(xì)胞周期，可協(xié)同增強(qiáng)同源性定向修復(fù)（HDR）的頻率。但是，高頻HDR編輯主要導(dǎo)致雙等位基因報(bào)告基因系統(tǒng)中純合突變體的產(chǎn)生，為了在這些條件下生產(chǎn)雜合突變體，這個(gè)團(tuán)隊(duì)采用了使用混合ssODN修復(fù)模板的策略，來保護(hù)具有沉默突變的一個(gè)等位基因。在內(nèi)源性常染色體位點(diǎn)應(yīng)用此協(xié)同基因編輯策略，與基線HDR水平相比，準(zhǔn)確編輯生成的雜合和純合突變提高了幾倍。

　　考慮到基因編輯的iPS細(xì)胞在細(xì)胞治療中應(yīng)用，采用符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的Maxcyte電轉(zhuǎn)儀測試設(shè)定的實(shí)驗(yàn)條件，比較正常培養(yǎng)，冷休克，冷休克和N+S條件下DNA修復(fù)結(jié)果頻率，在兩種不同供體遺傳背景下產(chǎn)生雜合和純合GFP iPS細(xì)胞系。利用Maxcyte電轉(zhuǎn)技術(shù)，在冷休克條件下，結(jié)合XL413和N+S處理，在雜合GFP iPS細(xì)胞的單等位基因編輯過程中，同源性定向修復(fù)（HDR）結(jié)果達(dá)到83.3%，在純合GFP iPS細(xì)胞的雙等位基因編輯中，HDR結(jié)果達(dá)到了96.6%。此外，當(dāng)采用混合ssODN M和B修復(fù)模板編輯純合GFP iPS細(xì)胞時(shí)，獲得了32.2%的復(fù)合雜合子。實(shí)驗(yàn)人員由此得出，協(xié)同基因編輯導(dǎo)致所有目標(biāo)基因座上HDR頻率提高了幾倍，證實(shí)了該策略在靶向人類基因組方面的廣泛適用性。

　　5個(gè)基因座（KCNH2 N588D/N588K,APRT M136T,HES7 R25W and PSMB8 G201V）上，在XL+N+S處理下32個(gè)克隆中獲得18-23個(gè)具有HDR等位基因（56%-72%總HDR效率）。與N+S聯(lián)用時(shí)，XL413引起的細(xì)胞周期停滯對HDR率的影響強(qiáng)于冷休克處理。其他5個(gè)基因座(KCNE1 D85N,KCNH2 N45D,SCN5A A1428S,and KCNJ11 T293N/T294M)的編輯效率低由于gRNA活性低。

　　總之，這些結(jié)果證實(shí)了，在不同電轉(zhuǎn)儀器和iPS細(xì)胞系間，通過細(xì)胞周期同步和DNA修復(fù)途徑調(diào)節(jié)的協(xié)同基因編輯可有效地產(chǎn)生純合和復(fù)合雜合突變克隆。參考圖1

　　研究結(jié)論及意義

　　研究人員采用化學(xué)和細(xì)胞培養(yǎng)條件干預(yù)措施，在人iPS細(xì)胞ssODN介導(dǎo)的基因編輯過程中，試圖使DNA修復(fù)結(jié)果偏向于HDR。冷休克已被證明在低溫下對細(xì)胞功能有多種影響，例如細(xì)胞代謝減慢，凋亡途徑激活，基因表達(dá)改變和細(xì)胞周期停滯?；蚓庉媽?shí)驗(yàn)中，冷休克可提高HDR效率，但其機(jī)制仍不清楚。本研究表明冷休克可減慢細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞處于G2/M期累積，并降低DNA合成速率。另外，冷休克可通過其他細(xì)胞周期依賴的效應(yīng)來表現(xiàn)，如核酸酶穩(wěn)定性、gRNA結(jié)合或DNA裂解動(dòng)力學(xué)和修復(fù)中間體的穩(wěn)定性，翻譯后調(diào)控和細(xì)胞活力。參考圖2

　　細(xì)胞周期調(diào)節(jié)是DNA修復(fù)和基因編輯領(lǐng)域中持續(xù)不斷的研究課題。本研究報(bào)道了在iPS細(xì)胞中CDC7抑制劑XL413可增強(qiáng)基因編輯。XL413在癌細(xì)胞系中在S/G2/M期積聚細(xì)胞，在核型正常細(xì)胞中阻滯在G1/早S期，與iPS細(xì)胞中觀察一致的。

　　研究人員發(fā)現(xiàn)，NHEJ抑制劑NU7441和SCR7分別提高了iPS細(xì)胞中HDR效率，聯(lián)合使用時(shí)，進(jìn)一步提高了HDR效率。DNA-PKcs在DSB形成后被特異性激活，并募集NHEJ途徑的蛋白組分，包括可連接DNA末端的DNA連接酶IV。作者懷疑利用NU7441抑制DNA-PKcs可能會(huì)繞過NHEJ復(fù)雜的裝配，并允許選擇其他替代DNA修復(fù)途徑，而對于下游利用SCR7抑制DNA連接酶IV，細(xì)胞可能已經(jīng)致力于利用NHEJ或其他替代MutEJ修復(fù)。這可能解釋，與SCR7處理相比，NU7441具有更高的HDR效率。研究人員一次報(bào)告細(xì)胞周期同步和DNA修復(fù)途徑調(diào)節(jié)對準(zhǔn)確基因編輯有協(xié)同影響。

　　使用本研究的方法，在不同電轉(zhuǎn)平臺(tái)間，協(xié)同基因編輯作用結(jié)果相似的。在純合GFP iPS細(xì)胞的雙等位基因編輯中，與NEPA Gene電轉(zhuǎn)儀HDR 48.9%比，Maxcyte具有更高的效率，HDR結(jié)果達(dá)到了96.6%,編輯效率高了2倍。與以前報(bào)道一致，通過準(zhǔn)確地單等位基因編輯形成的單個(gè)HDR等位基因主要與第二等位基因中插入缺失配對。因此，采用混合ssODN策略來創(chuàng)建可防止Cas9再裂解的復(fù)合雜合突變等位基因，當(dāng)采用混合ssODN M和B修復(fù)模板編輯純合GFP iPS細(xì)胞時(shí)，Maxcyte獲得的復(fù)合雜合子比NEPA Gene高了2.9倍（32.2%vs 11.2%）?？紤]到基因模型的內(nèi)源性靶標(biāo)，在多個(gè)基因座上實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生純合和復(fù)合雜合突變，結(jié)果證明協(xié)同基因編輯始終將HDR結(jié)果頻率提高到基線HDR水平的幾倍。

　　總之，研究人員建立了一個(gè)雙等位基因報(bào)告系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠解決特定的等位基因DNA修復(fù)結(jié)果，并定義了協(xié)同基因編輯條件，可使用冷休克，細(xì)胞周期同步和DNA修復(fù)調(diào)節(jié)來提高HDR和HDR/MutEJ比率。利用高效的雙等位基因修飾方式，展示了產(chǎn)生復(fù)合雜合iPS細(xì)胞系的策略。根據(jù)研究結(jié)果可預(yù)測，提高雙等位基因編輯結(jié)果的可靠性將促進(jìn)顯性和隱性遺傳疾病模型的產(chǎn)生，結(jié)合符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，甚至可能促進(jìn)使用人iPSC細(xì)胞療法的臨床開發(fā)。

　　參考文獻(xiàn)：

　　Thomas L.Maurissen&Knut Woltjen.Synergistic gene editing in human iPS cells via cell cycle and DNA repair modulation.Nature Communications.08 June 2020

　　https://www.nature.com/articles/s41467-020-16643-5#Abs1

　　Author：Department of Life Science Frontiers,Center for iPS Cell Research and Application(CiRA),Kyoto University,Kyoto,606-8507,Japan

　　關(guān)于Maxcyte公司

　　Maxcyte是一家臨床階段細(xì)胞免疫治療和生命科學(xué)公司，是細(xì)胞療法領(lǐng)域早期的先驅(qū)公司之一，總部位于美國馬里蘭州蓋瑟斯堡。作為一家全球運(yùn)營的生物科技公司，利用專利性的非病毒細(xì)胞工程平臺(tái)，即流式電轉(zhuǎn)技術(shù)平臺(tái)，為全球生物醫(yī)藥行業(yè)的合作伙伴賦能，幫助客戶開發(fā)創(chuàng)新性的細(xì)胞療法，來滿足病人對先進(jìn)細(xì)胞療法的需求。利用Maxcyte ExPERT電轉(zhuǎn)平臺(tái)結(jié)合基因編輯手段安全高效可高度重復(fù)地對人體原代細(xì)胞進(jìn)行遺傳改造，在符合臨床使用的嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)前提下，用于治療遺傳性疾病和癌癥。Maxcyte具有全球技術(shù)支持網(wǎng)絡(luò)，目標(biāo)是幫助合作伙伴釋放它們產(chǎn)品的所有潛能。

　　Maxcyte已被全球范圍內(nèi)用戶認(rèn)可，全球前十制藥公司都采用Maxcyte技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行藥物研發(fā)，歐美主要基因編輯和細(xì)胞治療公司與Maxcyte合作進(jìn)行新型的基因和細(xì)胞治療產(chǎn)品開發(fā)，如Allogene therapeutics，Editas medicine，CRISPR Therapeutics，Precision biosciences和Kite pharma等。多個(gè)頂級學(xué)術(shù)研究機(jī)構(gòu)采用Maxcyte技術(shù)研究哺乳動(dòng)物細(xì)胞和干細(xì)胞，如日本京都大學(xué)iPS細(xì)胞研究所（CIRA）和美國賓夕法尼亞大學(xué)。